| Especialidad |
Continuar con la coordinación y supervisión del Laboratorio de cultivo celular del INIBIOLP, así como también con la tarea de crionización, descongelamiento y mantenimiento de las líneas celulares (A549, Hep G2, CHO, etc) de uso común. Preparar medios de cultivos específicos de las distintas líneas celulares, tanto comerciales como artesanales. Inspeccionar los cultivos de células para constatar la ausencia de Micoplasma por microscopía de fluorescencia (utilizando los colorantes HOECHST y DAPI). Examinar el efecto antiproliferativo y citotóxico de aceites esenciales de frutas y plantas aromáticas en células en cultivo y ponderar su potencial utilización en el tratamiento del cáncer analizando su selectividad por células tumorales. Células tumorales y no tumorales se incubarán con concentraciones crecientes de los aceites a evaluar y se determinará la proliferación celular por conteo de células y por medición de síntesis de ADN (por incorporación de 3H-timidina o mediante el ensayo Click-iT® EdU) y la citotoxicidad mediante el test de MTT y la técnica de exclusión de azul tripán determinando para cada tipo celular los valores de IC50 (concentración de monoterpenos que inducen muerte celular en un 50%). Se incubará a las células con concentraciones de los aceites esenciales correspondientes a los IC50 y se analizarán algunos de los posibles mecanismos antiproliferativos para lo cual se determinará: el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular por citometría de flujo, la apoptosis por la técnica de TUNEL y niveles de pAMPK (proteína quinasa activada por AMP fosforilada) y localización subcelular de la proteína Ras por Western-blot. Evaluar los efectos y mecanismos de acción del aceite esencial de mandarina (AEM) sobre el contenido lipídico y la síntesis y captación de colesterol en células hepáticas. Se utilizarán células Hep G2 (provenientes de un hepatoblastoma humano) como modelo de células hepáticas, cultivadas en MEM con sales de Earle, piruvato de potasio y suero fetal bovino inactivado al 10 %. La síntesis de lípidos celulares se determinará por incorporación de [14C]acetato adicionado al medio de cultivo. Los lípidos totales serán extraídos y se separán Colesterol libre (CL) y esterificado (CE), Triacilglicéridos (TG) y los distintos tipos de fosfolípidos (FL) por cromatografía en capa fina (TLC) haciendo un doble desarrollo. La radiactividad incorporada se revelará por autorradiografía y se cuantificará por análisis densitométrico utilizando analizador de imágenes. Los distintos tipos de lípidos serán identificados por comparación con estándares puros. Los lípidos insaponificables se extraerán y serán separados por TLC utilizando cloroformo 100% como solvente de corrida. La radiactividad incorporada se revelará y cuantificará como se describió anteriormente. Colesterol, lanosterol, dolicol, ubiquinona y escualeno serán identificados por comparación con estándares puros. Los distintos tipos de lípidos celulares separados por TLC serán cuantificados. Las regiones correspondientes a FL y TG serán removidas de la placa y se cuantificará fósforo por métodos boquímicos y TG utilizando un kit comercial. El CL y CE se detectarán con una solución ácida de cloruro férrico aplicada en forma de spray y la intensidad de las manchas se cuantificará utilizando un Software de análisis de imágenes ImageJ. Se determinará la actividad HMG-CoA reductasa (HMGR) por espectrofotometría (midiendo desaparición de NADPH) utilizando células lisadas por sonicación como fuente de enzima. Se determinarán los niveles de HMGR, receptores para LDL y SREBP2 por por Western-blot y cuantificará el ARN mensajero correspondiente a cada una de esas proteínas por RT-PCR. |
(Federación Bioquímica de la Provincia Buenos Aires, 2013-04)
(Royal Society of Chemistry, 2018-04)
(Elsevier Science Inc, 2015-12)
(Taylor & Francis Ltd, 2012-04)
(Springer Heidelberg, 2017-01)
(Elsevier Science, 2013-02)
(Lawrence Erlbaum Assoc Inc-taylor & Francis, 2014-05)
(Elsevier Ireland, 2014-05)
(National Research Council Canada-NRC Research Press, 2013-05)